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褪色（光褪色）は、調査下のサンプルの蛍光強度が次第に減衰することです。 これは、特に、Widefield 3D、Widefield タイムシリーズ、Spinning Disc タイムシリーズ、コンフォーカルタイムシリーズ、STED タイムシリーズの画像に影響します。 Z スタックおよびタイムシリーズ画像の褪色は、Huygens Bleaching Corrector ツールを使用して正常に補正できます。

メカニズム

蛍光顕微鏡の性能は、サンプル内の蛍光色素として機能する化学成分に依存します。 蛍光分子から放出される光の量に影響を与える多くのメカニズムがあります。 これらのメカニズムは、蛍光分子の種類だけでなく、サンプルの環境にも依存します。 これにより、各蛍光分子の寿命が決まり、分子が使用できなくなる前に、何回の吸収-蛍光サイクルを受けることができるかが決まります。 光褪色の起源に関する一般的な理論のいくつかを次に示します。

光酸化
光褪色の主な原因は、励起された蛍光分子とサンプルに溶解した酸素分子との反応であると思われます。色素分子は、従来の励起状態よりも寿命が長く、より反応性の高い二次励起状態に移行する可能性があります。 これにより、酸素と反応することが可能になります。 二次励起状態が酸素と反応すると、寿命がさらに長くなるため、蛍光強度が大幅に抑制されます。

有機反応
光褪色の 2 番目の実行可能な説明は、色素分子と環境からの有機分子との反応です。 色素分子がより反応性が高く長寿命の励起状態に移行すると、分子は、タンパク質および脂質などの細胞内有機分子と不可逆的な化学反応を起こす可能性があります。 その結果、蛍光を発しない新しい分子ができます。

マルチフォトンイベント
光褪色は、すでに励起された状態の蛍光分子による 1 つまたは複数のフォトンの吸収によっても引き起こされる可能性があります。 別のフォトンが当たると、より反応性の高い状態に移行するか、イオン化することができます。 反応状態の場合、前述のプロセスのいずれかにつながる可能性があります。 イオン化の場合、分子は蛍光を発することもできません。 ただし、これらのイベントが発生するには、励起強度が 1 フォトンイベントの場合よりも数桁高くなる必要があります。

低減

このテーマについて多くの研究が行われてきました。 褪色の種類と大きさは、色素分子の組成とサンプルの環境によって異なります。 したがって、褪色低減の最初のステップは、最も光安定性の高い蛍光分子を選択することです。 第二に、サンプルを脱酸素化することで褪色を減らすことができます。 これは、N₂ をサンプルに通すか、アスコルビン酸などの酸素除去剤を使用することによって行うことができます。

褪色補正

Huygens Professional と Huygens Essential には、状況によっては褪色を補正するツール（Equalize Flux）があります。 詳細については、褪色モードを参照してください。 ブリーチング対サンプリングも参照してください。
Huygens 17.04 以降、Essential と Professional の両方に高度な Bleaching Corrector ツールが含まれており、Z スタックとタイムシリーズでの褪色補正をより対話的にコントロールできます。