Image Clipping
クリッピングは、最も頻繁に発生する画像取得の落とし穴の 1 つです。 当社の Huygens Imaging Academy では、ほとんどの画像取得に関する落とし穴の概要を確認し、それらを防ぐ方法についてアドバイスを提供しています。
入力信号のダイナミックレンジがアナログデジタルコンバーター（ADC）のダイナミックレンジを超えると、画像取得時に、クリッピングが発生します。 実際には、これは、実際に、最大値をより大きな数値で表す必要があるか、または入力画像の最小値が実際に、より低い強度を持つことを意味します。
適切にダウンスケーリングせずにダイナミックレンジの低いファイル形式を使用して、データを保存すると、データ処理時に、クリッピングが発生することもあります。 例えば、12 ビット画像を 8 ビット RGB TIFF 形式で直接、保存すると、255 を超えるすべての強度がクリップされます。
これは、クリップされた画像の例です、関心のある対象物のすべての内部領域が一定の最大値に飽和しており、内部構造は、もはや観察できません。
画像（*）提供： ヒューストン、ベイラー医科大学、神経科学科の T.M. Hoogland 博士。 この画像は、急性海馬スライスの CA1 錐体ニューロンの先端樹状突起の一部を示しています。 細胞に蛍光指示薬 Alexa 594（100 uM）を充填し、2 フォトンレーザースキャニング顕微鏡で画像化しました。
何が起きているか
微小物体からの光強度は、調整可能な増幅器を通過する電気信号に変換されます。 また、電気的な DCコンポーネントは、顕微鏡オペレータによって追加、または減算できます。 したがって、電気信号は、負から高い正の範囲に及ぶ可能性があります。 これらの電気信号は、コンピュータによって処理される数値に変換する必要があります。CCD センサーを備えた顕微鏡では、この変換は、CCD カメラとその電子機器で行われます。 ほとんど の CCD カメラには、出力数を 0 ～ 4095 の範囲に制限する 12 ビットコンバータがあります。 通 常、負の入力信号は、0 に変換されますが、ある値を超える正の入力値は、すべて 4095 に変換されま す（クリッピング）： クリップされたサンプルの情報は、失われます。
スキャニング顕微鏡では、通常、電気信号は、光電子増倍管によって生成され、上で概説したのと同様 の回路によって増幅されます。 古い顕微鏡では、多くの場合、信号は、8 ビット ADC によってデジタ ル化されます； 最近のシステムには、12 ビット ADC が装備されています。
クリッピングは、情報の損失を意味します
クリッピングは、検出器の飽和として理解できます。蛍光顕微鏡では、画像クリッピングにより、閾値を超える強度値を持つすべてのボクセルが同じ固定強 度で読み取られます。 これらのボクセルの実際の強度を後で再構築することは不可能です。
山の頂上を写さずに写真を撮るようなもので、下の部分を見ただけでは、本当の形状、または大きさが もはやわからなくなってしまいます。 この山の正体は？
通常、クリップされたボクセルは、上の最初の画像のように、画像の最も関心のある領域、サンプルの 最も明るい特徴にあります。 そのため、クリッピングを避けることが非常に重要です。
実際には： 画像の極端な値を見つけた場合は、疑ってください、おそらくクリッピングが発生していま す。 スキャニング顕微鏡で平均化を使用していた場合、（デジタル）平均化の前に、一部のサンプルで クリッピングが発生している可能性もあります。 これにより、消光のような効果が生じ、デコンボリュ ーションの効果が低下します。
画像取得時に、適切なオフセットとゲイン設定を使用することで、クリッピングを防ぐことができます。 ほとんどの顕微鏡画像取得ソフトウェアパッケージには、最適な設定を決定するのに役立つツールが含 まれています。 このツールは、「Range Indicator」、または「Color range indicator」と呼ばれるこ とがよくあります。
ヒストグラムを使用したクリッピングの検出
適切に測定された画像の画像ヒストグラムは、ゼロになり、すべての情報がダイナミックレンジ内に適切に記録されていることが示されます（右図）。 一方、クリップされた画像は、ゼロにはなりません（左図）：
特定の強度を持つピクセルの量は、高い強度（ヒストグラムの右側）になると減少しますが、検出器が飽和する前に、ゼロになるほど速くはありません。 実際の強度が最大値よりも高いピクセルが多数あり、それらは、このダイナミックレンジで許可されている最大強度に「折りたたまれ」ます。 （これは、ヒストグラムの最後の値で幅 1 ピクセルの緑色のバーで表されます。 これは、対数線形ヒストグラムであるため、高さの 2 倍は、ピクセルの量の 2 倍よりもはるかに多くなります。）
この場合、使用可能なダイナミックレンジの大部分は、まったく使用されません。 ダイナミックレンジを実際の強度に完全に適合させるのは、難しい場合があるため、保守的であり、クリッピングが発生する一部を無駄にすることは常に良いことです。
実用例
Raw image
''Restored image'
画像提供： ライデン大学医療センター、分子細胞生物学部門の J.A. Valentijn 博士。 生の画像は、 Bio-Rad 2100MP コンフォーカル／マルチフォトンシステムで取得しました（ここでは、マルチフォト ンオプションは使用しませんでした）。 この画像は、4 % パラホルムアルデヒドで固定されたラット結 腸組織の厚さ 7 マイクロメートルのクライオスタット切片から取得されました。 この切片は、小さな GTP 結合タンパク質である rab3D に対するウサギ抗体、および二次 Alexa-488 ヤギ抗ウサギ抗体 （緑色のチャネル）、および Alexa-594 標識グリフォニアシンプリシフォリア II レクチンで標識され ました。 各 V 字型の蛍光構造は、杯細胞（腸内の上皮細胞を分泌する粘液）のゴルジ体を表していま す。
復元された画像は、過大評価された S/N 比（SNR）でデコンボリューションされ、バックグラウンドにいくつかのアーティファクトが表示されますが、ここでは調べません。 SNR の記事で詳しく説明されています。
ここで重要なのは、画像の中央にあるこれらの緑色の中空構造です。
それらは、中空の対象物として復元されますが、これは、クリッピングされた領域をデコンボリューションした結果のアーティファクトである可能性が非常に高いです。 これらの対象物および周囲の他の対象物では、元の強度が切り取られている（飽和している）ため、デコンボリューションは、特に、単一の 2D スライスで現実的な解を見つけることができません。このような平坦化された特徴の数学的解は、中空の対象物です!