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共定位分析 (Colocalization)

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共定位分析功能是多维、多萤光通道显微图像中最常用的分析功能之一。 Huygens ProfessionalEssential 软件能为您提供这个重要的分析功能,Huygens 软件能为您的多维图像(包括时间序列)的萤光通道之间的相互重叠的关系作出定量的分析。

Huygens 软件为您提供以下九个不同的共定位相关系数:
  • Pearson , Object Pearson
  • Spearman, Object Spearman
  • Overlap,
  • Manders M1,2 及 K1,2
  • Global intersection coefficient
  • Per-channel i1 and i2 intersection coefficients 的相关系数

共定位的定义及简单背景:

共定位是用来介定两个萤光通道之间重叠的相互关系,这个关系常用于细胞生物学、神经科学等项目中。例如:某一蛋白质在细胞中那一个细胞器中表达出来,这个蛋白质在正常细胞及病理细胞表达的差异,进行量化,于是数据、结果可以作出比较、进行有系统的分析。

以下例子我们假设一个萤光通道为 R (红色) ,而另一个通道为 G (绿色) 。

如果我们把左、右 (R 与 G) 合并,两者可以是 100% 重叠:
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或 66% 重叠,可是 66% 重叠可以是图一或图二: 图一与图二是两个完全不同情况,图一的结果可以是 100% 的 G 与 R 重垒,而 66% 的 R 与 G 重叠。而图二,R 与 G 的重叠是 66%。
图一
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图二
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所以,我们需要不同的共定位相关系数....

针对与另一通道不重叠的讯号
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不受强度的改变的影响(一激光强度比另一激光强度大或小)
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不受背景强度的影响
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去卷积及图像修正绝对对共定位的结果带来正面的影响:模糊、噪音、背景强度、色差及 Cross Talk 都必需先修正,再进行共定位分析。以下的图像是一个很好的例子,去卷积及图像恢复后对共定位结果的影响。图像修复前,红色讯号因模糊而与大部份绿色讯号重叠,去卷积后,两个通道之间的重叠明显减少,事实上,这个结果更有代表性。


Top picture: XY projections and bottom picture: YZ, XZ projections. Original data as acquired in a Nipkow Disk Microscope shown next to the same image after applying Huygens Deconvolution. The red and green signals are clearly separated much more after the restoration. Calculating colocalization in the original data would have caused fake colocalization levels. Data courtesy Dr. Kozubek, Brno, Czech republic, FP6 3DGenome Project
Top picture: XY projections and bottom picture: YZ, XZ projections. Original data as acquired in a Nipkow Disk Microscope shown next to the same image after applying Huygens Deconvolution. The red and green signals are clearly separated much more after the restoration. Calculating colocalization in the original data would have caused fake colocalization levels. Data courtesy Dr. Kozubek, Brno, Czech republic, FP6 3DGenome Project


共定位相关系数的简单定义:


*Pearson
是由數學家 Karl Perason 提出的,是统计學中最常用刭的,這個系數代表兩個螢光通道的相互关系,如果相關系數等於 1 ,代表通道之間是完全重疊;如果相关系數越接近 1,兩通道的重疊或相关程度越大。數值越小,其互相重疊的程度越小。這個數值在 -1 与 1 之间。

*Object Pearson
与 Pearson 的計算是一樣,可是在計算中,Huygens 軟件只测量强度大於背景的訊號,所以這個系數只测量物体 (Object) 本身,因此這個系數的名称为 Object Pearson。

*Spearman
這個相关系數是由 Charles Spearman 提出的,這個系數与 Pearson 系數差不多,他侦测單調函数的数据 (Monotonic),這個計算是先测量通道的强度,加以分辨:强度較大的,定義為 Rank 1,强度較弱的為 Rank 2,如此類推,再利用 Pearson 的计算方法计算出兩通道之間的相关系數。

*Object Spearman
与 Object Pearson 一樣,計算方法与 Spearman 並無太大的分別,Huygens 在测量時只测量物体 (Object),背景强度或並非物体的讯号並不包括在测量中,所以有 Object Spearman 的名稱。

*Overlap
是由 Erik Manders 提出的,代表在两个互相重叠、交叉的物体体积比例。这个相关系数只限用于物体的体积在每一个通道是一样的,而且每一通道的强度在物体中不变。

*Mander k1,k2
这个相关系数也是由 Manders 的论文中提出的,它是用来定义两个萤光通道之间的重叠、交叉关系 (例如:所有 R 讯号重叠于 G,可是不一定所有 G 讯号重叠于 R),这个系数与两个通道的强度 (total intensity) 有密切关系。

*Mander M1,M2
由以上 Mander k1,k2 系数演算而来的,这个系数分别计算两个通道重叠、交叉的部份,一个通道的与另一个通道交叉的强度。这个方法计算一个通道中带有另一个通道的体素(voxels ),而这个系数与实际数值是独立的,所以两通道之间的强度比例并不影响这个系数的结果。

*Global intersection coefficient
这是本公司提出的,Huygens 軟件獨有的共定位系数。這個方法非常直接,是交叉体積与總体積的比例。這個系數的 100 倍就是這個交叉体積的百分比。

*Per-channel i1 and i2 intersection coefficients
這個系數是基於以上 Global intersection coefficient 的系數,可是把每一個通道分割出來。它代表一通道中与另一通道中有重疊、交叉的物体体積

如果您对以上的系数有兴趣,可以参考更详细的背景说明(背景理论例子去了解这些系数,以上的两个连线目前只有英语版)。

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