共定位分析 (Colocalization)

共定位分析功能是多维、多萤光通道显微图像中最常用的分析功能之一。 Huygens Professional 及 Essential 软件能为您提供这个重要的分析功能，Huygens 软件能为您的多维图像（包括时间序列）的萤光通道之间的相互重叠的关系作出定量的分析。

Huygens 软件为您提供以下九个不同的共定位相关系数：

• Pearson , Object Pearson
• Spearman, Object Spearman
• Overlap,
• Manders M_1,2 及 K_1,2
• Global intersection coefficient
• Per-channel i1 and i2 intersection coefficients 的相关系数

共定位的定义及简单背景：

共定位是用来介定两个萤光通道之间重叠的相互关系，这个关系常用于细胞生物学、神经科学等项目中。例如：某一蛋白质在细胞中那一个细胞器中表达出来，这个蛋白质在正常细胞及病理细胞表达的差异，进行量化，于是数据、结果可以作出比较、进行有系统的分析。

以下例子我们假设一个萤光通道为 R (红色) ，而另一个通道为 G (绿色) 。

如果我们把左、右 (R 与 G) 合并，两者可以是 100% 重叠：


或 66% 重叠，可是 66% 重叠可以是图一或图二： 图一与图二是两个完全不同情况，图一的结果可以是 100% 的 G 与 R 重垒，而 66% 的 R 与 G 重叠。而图二，R 与 G 的重叠是 66%。
图一


图二



所以，我们需要不同的共定位相关系数....

针对与另一通道不重叠的讯号


不受强度的改变的影响（一激光强度比另一激光强度大或小）


不受背景强度的影响


而去卷积及图像修正绝对对共定位的结果带来正面的影响：模糊、噪音、背景强度、色差及 Cross Talk 都必需先修正，再进行共定位分析。以下的图像是一个很好的例子，去卷积及图像恢复后对共定位结果的影响。图像修复前，红色讯号因模糊而与大部份绿色讯号重叠，去卷积后，两个通道之间的重叠明显减少，事实上，这个结果更有代表性。

共定位相关系数的简单定义：

*Pearson
是由數學家 Karl Perason 提出的，是统计學中最常用刭的，這個系數代表兩個螢光通道的相互关系，如果相關系數等於 1 ，代表通道之間是完全重疊；如果相关系數越接近 1，兩通道的重疊或相关程度越大。數值越小，其互相重疊的程度越小。這個數值在 -1 与 1 之间。

*Object Pearson
与 Pearson 的計算是一樣，可是在計算中，Huygens 軟件只测量强度大於背景的訊號，所以這個系數只测量物体 (Object) 本身，因此這個系數的名称为 Object Pearson。

*Spearman
這個相关系數是由 Charles Spearman 提出的，這個系數与 Pearson 系數差不多，他侦测單調函数的数据 (Monotonic)，這個計算是先测量通道的强度，加以分辨：强度較大的，定義為 Rank 1，强度較弱的為 Rank 2，如此類推，再利用 Pearson 的计算方法计算出兩通道之間的相关系數。

*Object Spearman
与 Object Pearson 一樣，計算方法与 Spearman 並無太大的分別，Huygens 在测量時只测量物体 (Object)，背景强度或並非物体的讯号並不包括在测量中，所以有 Object Spearman 的名稱。

*Overlap
是由 Erik Manders 提出的，代表在两个互相重叠、交叉的物体体积比例。这个相关系数只限用于物体的体积在每一个通道是一样的，而且每一通道的强度在物体中不变。

*Mander k₁，k₂
这个相关系数也是由 Manders 的论文中提出的，它是用来定义两个萤光通道之间的重叠、交叉关系 (例如：所有 R 讯号重叠于 G，可是不一定所有 G 讯号重叠于 R），这个系数与两个通道的强度 (total intensity) 有密切关系。

*Mander M₁，M₂
由以上 Mander k₁，k₂ 系数演算而来的，这个系数分别计算两个通道重叠、交叉的部份，一个通道的与另一个通道交叉的强度。这个方法计算一个通道中带有另一个通道的体素（voxels )，而这个系数与实际数值是独立的，所以两通道之间的强度比例并不影响这个系数的结果。

*Global intersection coefficient
这是本公司提出的，Huygens 軟件獨有的共定位系数。這個方法非常直接，是交叉体積与總体積的比例。這個系數的 100 倍就是這個交叉体積的百分比。

*Per-channel i1 and i2 intersection coefficients
這個系數是基於以上 Global intersection coefficient 的系數，可是把每一個通道分割出來。它代表一通道中与另一通道中有重疊、交叉的物体体積。

如果您对以上的系数有兴趣，可以参考更详细的背景说明（背景理论，例子去了解这些系数，以上的两个连线目前只有英语版）。