コロカリゼーション理論
(Microscopy colocalization theoretical background)
コロカリゼーション係数の目的は、顕微鏡画像の 2 つのチャネル間のオーバーラップの程度を特徴付けることです。 これらの係数のいくつかは、文献で広く使用されており、原則として、さまざまな研究で得られた結果の比較に役立ちます。 したがって、SVI 社の Colocalization Analyzer は、これらの確立された係数に焦点を当てています。 それでも、この時点で、係数の特定の特性、特に、画像のバックグラウンドに関連する特性がクロス研究比較を問題にすることに注意する必要があります。
一般的に、コロカリゼーション係数は、画像のバックグラウンドと解像度の正確な評価に大きく依存します。 これらの理由から、デコンボリューションされた画像でだけコロカリゼーション係数を計算することを強く推奨します。 デコンボリューションは、コロカリゼーション解析を適切に強化することが証明されています（1、2）、ぼやけとノイズがコロカリゼーションに影響するを参照してください。 係数を生データから計算する必要がある場合、この関数でフレームごとに画像のバックグラウンドを計算することができます。
画像が色収差の影響を受けている場合は、Huygens Chromatic Aberration Corrector で画像を補正することをお勧めします。
コロカリゼーションに影響を与える実験上の問題の図については、コロカリゼーションの基本を参照してください。
以下の係数の定義では、比較する 2 つのチャネルの命名規則に従います：最初のチャネルは、R、2 番目のチャネルは、G です。チャネルのピクセル値は、それぞれ Ri と Gi で、i は、ピクセルインデックスです。係数は、2D および 3D 画像に適用される空間関係を考慮しないため、0 から N-1 までのインデックス i 、N は、画像要素の総数です。
コロカリゼーション係数の解釈に関する議論については、（3）を参照してください。
係数とマップ
以下で定義される係数は、画像全体をパラメータ化し、マップは、コロカリゼーションを局所的にパラメータ化します。3D マップを作成するボクセルごとに 1 つの値が計算され、3D 画像で表すことができます。Colocalization Analyzer は、等コロカリゼーション面の形式でマップをプロットし、特定のコロカリゼーションレベルを持つすべてのポイントを結合して、3D 面を形成します。このようにして、コロカリゼーションの程度が等値面の閾値を超える領域は、独立して解析できる対象物になります。
従来、比較対象の 2 つのデータチャネルは、R および G と呼ばれます。これらは、実際に登録されている波長とは関係なく、赤色および緑色のチャネルとしても知られています。
ピアソンのコロカリゼーション係数
ピアソンの線形相関係数を使用して、ピクセルのオーバーラップを測定できます。次のように定義されます：
$$ r_\mathrm{p} = \frac {\sum ((R_i - R_{\mathrm{avg}}) (G_i - G_{\mathrm{avg}}))} {\sqrt{\sum (R_i-R_{\mathrm{avg}})^2 \sum (G_i - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$
Ravg と Gavg を使用すると、それぞれ R チャネルと G チャネルの平均と、すべての画像ボクセルにわたるインデックス i の合計が得られます。rp の値は、-1 から 1 の間です。負の値は、Ravg を超える R の大多数の値が Gavg. を下回る G の値と一致する場合に起こります。 平均を含めることで、この係数は、画像のバックグラウンドから独立したものになります。 係数は、赤色と緑色のチャネルが線形方程式（G = a R + b） によって、どの程度関連しているかを表しますが、その方程式がどれであるかについては何も述べていません。 例えば、すべての赤色のボクセルの強度が緑色のボクセルの強度の正確に 2 倍である場合は、1 になりますが、比率が正確に 1.33、0.7、またはその他の係数（およびオプションの追加定数 b）である場合も同様です。rp が +/- 1.0 に近いほど、2 つのチャネルのすべてのボクセル強度がより線形的に関連しています。 実際の線形関係は、係数に影響しません。したがって、例えば、緑色のチャネル検出器が赤色のチャネルよりも低い強度出力で測定する場合でも、相関を計算できます。 係数は、チャネルの共分散と標準偏差の積との比率です。
ピアソンコロカリゼーションマップ MP は、次の値で構成されます：
$$ M_{\mathrm{P},i} = \frac {(R_i - R_{\mathrm{avg}}) (G_i - G_{\mathrm{avg}})} {\sqrt{\sum (R_i - R_{\mathrm{avg}})^2 \sum (G_i - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$
対象物ピアソン係数
この新しいピアソン係数は、Huygens バージョン 3.6 以降で利用できます。これは、上述したピアソン係数と同じですが、Ravg と Gi は、それぞれ Ri 値と Gi 値の平均であり、インデックス i は、対象物ボクセルだけ、つまり、Ri または Gi が閾値強度レベルよりも大きい i の場合です。このようにして、対象物ピアソン係数は、大きなバックグラウンド領域によって偏りがなくなります。
$$r_{\mathrm{op}} = \frac {\sum_i ((R_i - R_{\mathrm{avg}}) (G_i - G_{\mathrm{avg}}))} {\sqrt{\sum_i (R_i-R_{\mathrm{avg}})^2 \sum_i (G_i - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$, such that Ri > Rthresh \( \vee \) Gi > Gthresh
スピアマン係数
スピアマンの係数は、Huygens バージョン 3.7 以降の Colocalization Analyzer で見つけることができ、ピアソン係数と同じですが、強度値ではなく、強度ランクに基づいています。 ピアソン係数は、線形の依存関係だけを測定するのに対し、スピアマン係数は、2 つのチャネル間のすべての単調な依存関係を測定できるという追加の特性を与えるのがこの違いです。
強度値（Ri または Gi）の強度ランク（Rr または Gr）は、チャネルのすべての画像強度が順序付けられている場合、この値の位置によって決定されます。ランクは、平均ランクと比較されるため、これが降順であろうと昇順であろうと関係ありません。 Huygens では、最高強度値が最高ランク（=1）になります。
同点がある場合、これらの強度のランクは、画像強度の順序付けられたリストの平均位置です。スピアマン係数は、次のように定義されます：
$$ r_{\mathrm{s}} = \frac {\sum ((R_r - R_{\mathrm{avg}}) (G_r - G_{\mathrm{avg}}))} {\sqrt{\sum (R_r-R_{\mathrm{avg}})^2 \sum (G_r - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$
with Ravg = Gavg = \( \frac{n+1}{2} \) で、n は、画像ボリューム（ボクセルの総数）です。
対応するスピアマンコロカリゼーションマップは、次の値によって決定されます：
$$ M_{\mathrm{S},i} = \frac {(R_r - R_{\mathrm{avg}}) (G_r - G_{\mathrm{avg}})} {\sqrt{\sum (R_r - R_{\mathrm{avg}})^2 \sum (G_r - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$
スピアマン係数の例については、ウィキペディアのスピアマンの順位相関係数を参照してください。
対象物スピアマン係数
この係数は、Huygens バージョン 3.7 以降で利用できます。上述したスピアマン係数と同じですが、 Ravgr と Gavgr を使用すると、対象物に属する（つまり、特定の閾値強度レベルを超える）ボクセルの画像ランキング Rr と Gr の平均になります。 対象物ピアソン係数と同様に、対象物スピアマン係数は、大きなバックグラウンド領域によって偏りがなくなります。したがって、次のように定義されます：
$$r_{\mathrm{os}} = \frac {\sum_r ((R_r - R_{\mathrm{avg}}) (G_r - G_{\mathrm{avg}}))} {\sqrt{\sum_r (R_r-R_{\mathrm{avg}})^2 \sum_r (G_r - G_{\mathrm{avg}})^2}} $$, such that Rr > Rthresh\( \vee \) Gr > Gthresh
オーバーラップ係数
rp の負の値は、解釈が容易ではないため、平均値の減算を省略して、次のようにオーバーラップ係数を作成できます：
$$ r_{\mathrm{o}} = \frac {\sum (R_i\ G_i) } {\sqrt{\sum R_i^2 \sum G_i ^2}} $$
ro の値は、0 ～ 1 です。ピアソン係数と同様に、この係数は、チャネルの相対的な強度には依存しませんが、バックグラウンドの強度レベルには依存します。
オーバーラップコロカリゼーションマップ Mo は、次の値で構成されます：
$$ M_{\mathrm{o},i} = \frac {R_i\ G_i} {\sqrt{\sum R_i^2 \sum G_i ^2}} $$
マンダース係数
両方のチャネルが ro に寄与する方法の対称性の結果は、共局在化されていないシグナルが R チャネルと G チャネルに追加される状況を区別できないことです。
赤色のピクセルが緑色のピクセルとどれだけうまく共局在するか、また、その逆も知りたいと思うかもしれません。 例えば、赤色のシグナルが存在しない領域では、すべての赤色のピクセルが緑色のピクセルとオーバーラップしますが、緑色のピクセルの多くは、「単独」であるということが起こります（例えば、2 チャネルヒストグラムの最初の例を参照）。
この区別を行うために、ro を次の係数に分割できます：
$$ k_1 = \frac {\sum (R_i\ G_i)} {\sum R_i^2} $$
および
$$ k_2 = \frac {\sum (R_i\ G_i)} {\sum G_i^2} $$
これらの係数により、上記のケースを区別できます： G への共局在化されていないシグナルの追加は、k1 には影響しませんが、k2 には影響します。
それでも、これらの係数には、欠点がないわけではありません：k1 は、G のシグナル強度に比例してスケーリングし、同様に、k2 は、R のシグナル強度に比例してスケーリングします。
これらの係数をスケーリング効果から独立させる可能性は、Gi = 0 ； Gi = 1 以外の場合、k1 の定義の GI を 0 に置き換えることです。実際には、これは、Gi > 0 のすべての Ri の合計を取ることを意味します。これにより、マンダース係数として知られる次の係数が得られます：
$$ M_1 = \frac {\sum R_{\mathrm{coloc},i}} {\sum R_i} $$
および
$$ M_2 = \frac {\sum G_{\mathrm{coloc},i}} {\sum G_i} $$
この大文字の M 係数は、「マップ」ではなく、「マンダース」を意味することに注意してください。 k1、k2、M1、M2 係数のコロカリゼーションマップは、前の係数と同じ方法で構築されます。
交差係数
上述した係数は、すべてボクセル強度に基づいていますが、状況によっては、解釈が難しい場合があります。 実際の強度値とは関係なく、ボクセルに何らかのシグナルがあるかどうかに基づいて、より単純な（しかし、おそらく、より不安定な）係数を計算できます。 これらの新しい係数がどのように発生するかについてのいくつかの図については、実際の例を含むコロカリゼーション係数を参照してください。
ボクセルは、その値が特定の閾値強度レベルを超えると、何らかの関心のあるシグナルを持っていると見なすことができます。 そのような場合、その値は、実際の強度とは無関係に 1 と見なすことができ、それ以外の場合は、0 と見なすことができます。実際、これは、本当の赤色の強度 Ri と赤色の閾値強度レベル Rthresh に基づいて、ボクセル i で強度 Rweight,i を持つ赤色のバイナリ画像 Rweight を次のように定義することを意味します：
$$ R_{\mathrm{weight},i}=\begin{cases}0 & \text{ if } R_i\ \leq\ R_{\mathrm{thresh}} \\ 1 & \text{ if } R_{i}\ >\ R_{\mathrm{thresh}} \end{cases} $$
Gweight,i についても同様に、Gi と緑色の閾値強度レベル Gthresh に基づいています。
ノイズの多い画像では、強度が Rthresh と Gthresh に近い場合、バックグラウンドの周囲で急速に変動する 0 - 1 の値が生成される可能性があります。バックグラウンドの周りの遷移をよりスムーズにするために、特定の範囲内で、一部のボクセルに対して、0 と 1 の間の部分的な寄与が考慮されるように、ソフト閾値を定義できます：
$$ R_{\mathrm{weight},i}=\begin{cases}0 & \text{ if } R_i\ \leq\ (R_{\mathrm{thresh}} - \mathrm{range}/2) \\ f(R_{i}) & \text{ if } (R_{\mathrm{thresh}} - \mathrm{range}/2)\ <\ R_i <\ (R_{\mathrm{thresh}} + \mathrm{range}/2) \\ 1 & \text{ if } R_{i}\ \geq\ (R_{\mathrm{thresh}} + \mathrm{range}/2) \end{cases} $$
最も単純な関数 f(Ri) は、一次多項式です： 範囲制限 Rthresh ± range/2 の間の強度 Ri は、0 と 1 の間の値に線形にマッピングされます。これで、Rweight および Gweight 画像は、もはやバイナリではなく、強度が 0 から 1 のグレー値になっています。
与えられたボクセルの交差寄与は、Rweight と Gweight の積として定義できます。 最も単純なケース（ハード閾値）は、これらの寄与が常に、0 または 1 であることを意味します。 ソフト閾値の場合、一部のピクセルは、0 から 1 の間の値で合計係数に部分的に寄与します。 いずれの場合も、交差係数は、次の式で与えられます：
$$ \mathrm{intersection} = \dfrac {\sum (R_{\mathrm{weight},i}\ G_{\mathrm{weight},i})} {\sum R_{\mathrm{weight},i} + \sum G_{\mathrm{weight},i} - \sum(R_{\mathrm{weight},i}\ G_{\mathrm{weight},i}) } $$
分子： 総交差ボリューム（両方のチャネルで強度を持つボクセル）。 分母： 両方のチャネルを合わせた合計ボリューム、これは、赤色の合計ボリュームと緑色の合計ボリュームから交差ボリュームを差し引いたものとして計算されます（2 回の計算を避けるため）。
交差係数を分割して、赤色と緑色のボリュームのどの部分が交差しているかを報告することもできます：
$$ i_1 = \frac {\sum (R_{\mathrm{weight},i} \ G_{\mathrm{weight},i})} {\sum R_{\mathrm{weight},i} } $$
$$ i_2 = \frac {\sum (R_{\mathrm{weight},i} \ G_{\mathrm{weight},i})} {\sum G_{\mathrm{weight},i} } $$
リーのICQ
強度相関指数（ICQ）は、Li 等 （2004）で定義されました、シナプス前神経終末におけるシンタキシン 1、Galpha 0、および N 型カルシウムチャネル複合体： 定量的免疫共局在化による解析、Journal of Neuroscience、24(16)： 4070-4081。 各ボクセル「i」について、次の値が計算されます：
$$ (R_{i} - R_{avg}) (G_{i} - G_{avg}) $$
この値が正のボクセルをカウントし、この数をボクセルの総数で割ることによって、0 と 1 の間の比率が生成されます。 次に、その比率から 0.5 を引いて、ICQ を -0.5 ～ +0.5 の範囲にマッピングします。 ランダム染色または混合染色の場合、この数値は、0 に向かう傾向があり、分離染色の場合は、-0.5 に向かう傾向があり、依存染色の場合は、+0.5 に向かう傾向があります。 各ボクセルペアの強度の代わりに極性だけを使用することにより、この係数には、特に、高い染色強度または低い染色強度への偏りが除去されるという利点があります。
ヴァン・スティーンセルのCCF
Van Steensel の相互相関関数（CCF）は、van Steensel 等。（1996） で説明されています、ラット海馬ニューロンの核の個別のコンパートメントにおけるグルココルチコイドおよびミネラルコルチコイド受容体の部分的なコロカリゼーション、Journal of Cell Science 109、787-792。 赤色の画像を dx ボクセル（-20 ≤ dx ≤ 20） の距離にわたって移動した後、ピアソン係数を計算することによって得られます。 非ランダムなオーバーラップは、dx = 0 でピークになり、非ランダムの除外は、dx = 0 でくぼみになるため、CCF は、非ランダムなコロカリゼーションが発生するかどうかを評価するのに役立ちます。 無相関の分布では、CCF に明確なピーク、またはくぼみは見られません。
これらすべての係数の動作を確認するには、 コロカリゼーション係数を参照してください。
閾値処理
ピアソン係数
原則として、いずれかのチャネルに定数値（閾値）を差し引いても、ピアソン係数は影響を受けません。ただし、Colocalization Analyzer（Link-25）によって、計算されたすべての係数にわたって一貫した方法で指定された閾値設定を処理するために、閾値が考慮されます。Colocalization Analyzer で閾値（および閾値範囲）の値を指定すると、コロカリゼーションの計算時に、これらの値がすべてのピクセル強度から差し引かれます。負のピクセル値が発生した場合、これらは、ゼロに設定されます。これは、ユーザー指定の閾値を設定すると、結果のピアソン係数が変わる可能性があることを意味します。標準的な定義に従って、ピアソン係数を計算するには、閾値と閾値範囲の両方を 0 に設定する必要があります。
対象物ピアソン係数
[Huygens-Colocalization-Analyzer-Japanese のチャネルごとの閾値設定を使用して、Rthresh と Gthresh の値を決定できます。 閾値範囲の値を設定して、ソフト閾値を適用することもできます。 バイナリ対象物の閾値処理が必要な場合は、閾値の範囲を 0 に設定する必要があります。 ピアソン係数の計算と同様に、負のピクセル値は、ゼロに設定されます（結果の係数が変更される可能性があります）。
スピアマン係数と対象物スピアマン係数
Colocalization Analyzer のチャネルごとの閾値設定を使用して、バイナリ閾値を指定できます。 スピアマン係数の場合、この値を下回る強度のボクセルには、同じランクが与えられます（それらは、「バックグラウンド」としてランク付けされます）。 対象物スピアマン係数の場合、閾値を下回るボクセルは、計算に含まれません。 閾値範囲の設定は、スピアマンおよび対象物スピアマン係数には影響しません。
オーバーラップ係数
ピアソン係数の処理と同様に、チャネルごとの閾値と閾値範囲の値がピクセル値から減算されます、負のピクセル値は、0 に設定されます（結果の係数が変更される可能性があります）。
マンダース係数
上記で定義されたマンダース係数は、すべてバックグラウンドの強度レベルに敏感であるため、Ri と Gi は、バックグラウンドに対して補正できます。k1 および k2 係数については、ピアソンおよびオーバーラップ係数の閾値処理と同様に、チャネルごとの閾値および閾値範囲がすべてのピクセル値から差し引かれます。 これが負の値を生成する場合、ピクセル値は、ゼロに設定されます。M1 および M2 係数については、ソフト閾値も適用されます。 各要素は次のように計算されます：
$$ R_{\mathrm{coloc},i} = R_i \ G_{\mathrm{weight},i} $$ $$ G_{\mathrm{coloc},i} = G_i \ R_{\mathrm{weight},i} $$
マンダースの元の定義を取得するには、閾値と閾値の範囲を 0 に設定する必要があります。
交差係数
As described above, in calculating the intersection coefficient, the per-channel threshold setting can be used to specify a threshold intensity level . A Soft Threshold can also be applied by setting a threshold range value. 上述のように、交差係数を計算する際に、チャネルごとの閾値設定を使用して、閾値強度レベル Rthresh を指定することができます。閾値範囲の値を設定して、ソフト閾値を適用することもできます。
リーのICQ
ピアソン係数とオーバーラップ係数の処理と同様に、チャネルごとの閾値と閾値範囲の値がピクセル値から差し引かれます、負のピクセル値は、0 に設定されます（結果の係数が変更される可能性があります）。
ヴァン・スティーンセルのCCF
Van Steensel の CCF では、ピアソンの係数と同じ閾値処理が使用されます。
詳細情報
スケーリングはレシオメトリに影響します
上述したように、ほとんどのコロカリゼーションパラメータは、チャネルの相対的な強度をスケーリングしても影響を受けません。もちろん、これは、直接のチャネル比には、適用されません。詳細については、レシオメトリック画像を参照してください。
Huygens ソフトウェアでのコロカリゼーション
Tcl Huygens コマンド coloc を参照してください。
共起理論も参照してください。
参考文献
[1] Analysis of protein co-localization using wide-field fluorescence microscopy and image-restoration for co-visualisation of CFP and YFP conjugated signalling proteins inside living cells. J. Weitzman, R. Lizundia, B. Blumen, M. Marchand, S. Shorte.
[2] Deconvolution improves colocalization analysis of multiple fluorochromes in 3D confocal data sets more than filtering techniques. L. Landmann. Journal of Microscopy 208:2, 134 (2002).
[3] Measurement of co-localization of object in dual-colour confocal images. E.M.M. Manders, F.J. Verbeek and J.A. Aten. Journal of Microscopy 169, 375-382 (1993).