Setting the coverslip position
カバーガラスの位置パラメータを使用して、カバーガラスの表面と画像平面の間の距離を定義することにより、球面収差補正を最適化できます（詳細については、以下を参照）。 Z スタックの場合、カバーガラスに最も近い画像平面がカウントされます。 カバーガラス表面からすぐに Z スタックのイメージングを開始すると、値は、0 ミクロンになります。 私たちの知る限り、画像メタデータは、このパラメータ値を提供しません。 適用する方法は、最初にカバーガラス表面の汚れ、またはほこりに焦点を合わせ、対物レンズ／ステージの位置をマークすることです。 続いて、カバーガラスに最も近い画像平面の位置に注意する必要があります。 これら 2 つの位置の違いは、封入距離です。
顕微鏡の対物レンズが設計されている屈折率と封入溶媒の実際の屈折率との間にミスマッチがない場合、カバーガラスの位置の影響は、無視できます。
ただし、レンズと封入溶媒の屈折率が一致しない場合、点像分布関数（PSF）の形状は、球面収差（SA）により、歪んでしまいます。 標本のより深い層がイメージングされ、カバーガラスから離れるにつれて、この歪みは、徐々に悪化します。 球面収差を計算するには、カバーガラスと最初の画像平面（つまり、対物レンズに最も近い画像平面）の間の距離を知る必要があります。 多くの場合、カバーガラスの位置は、データの最初の平面と一致しないため、この位置は、Huygens Essential と Professional の両方で、顕微鏡パラメータエディタで設定できます。 私たちの知る限り、メタデータにカバーガラスの位置を記録する既存の顕微鏡画像ファイルは、ありません。 多くの場合、カバーガラスの位置は、カバーガラス上の小さな対象物に顕微鏡の焦点を合わせ、最初の像面に焦点を合わせるためにステージを Z 方向にどれだけ移動する必要があるかを記録することで決定できます。 この距離を使用して、Huygens カバーガラスエディタで Z スタックからカバーガラスをさらに離して配置できます。
Y 方向に沿ったデータの XZ 最大強度投影（MIP）を示すカバーガラス位置エディタ。 青色の線をドラッグすると、カバーガラスの位置を編集できます。 現在、上向きのイメージング方向は、示されているように、データに対する対物レンズの位置によって示されます。 画像の左上に示されている Z 位置は、カバーガラスから最初のデータ平面までの距離をミクロン単位で示しています。
カバーガラス位置エディタは、次から起動できます：
- パラメータチェックステージ時の、Essential ウィザード、
- Huygens Professional パラメータウィザード（「Sampling density」ステージの「Set coverslip」ボタン）、
- Huygens Professional パラメータエディタ（レンチアイコンの付いたボタン）。
イメージング方向
倒立顕微鏡 倒立顕微鏡では、対物レンズが上を向いています。 エディタは、顕微鏡ファイルから読み取ったデータに対するカバーガラスの位置とイメージング方向を示します。 倒立顕微鏡では、対物レンズが物理的に標本の下にあるため、画面上の XZ MIP の最も低い位置に対応するデータの最初の XY 平面が、対物レンズに最も近い位置でスキャンされた XY 平面に対応する可能性があります。 この状況を上図に示します。 ただし、スキャン方向とデータ平面が並べ替えられている可能性があるため、この一致は、保証されません。 幸いなことに、多くの場合、対象物がガラスに付着している平らな面を簡単に見つけることができるため、向きを確認できます。
正立顕微鏡
これらの顕微鏡は、直立しているので、対物レンズを下に向けます。 このような正立顕微鏡では、Z スキャンがカバーガラスから離れて開始し、カバーガラスに近づくため、最初の平面も物理的に最も低い平面になる可能性があります。 その場合、イメージング方向は、下向きに設定し、カバーガラスの位置は、MIP 投影の上部に設定する必要があります。 ただし、これらの最初の平面を最初にデータセットに保存時に、スキャンがカバーガラスの近くで開始された場合、MIP 投影では、データが上下逆に表示されます。 その結果、カバーガラスの位置は、MIP の下部になり、イメージング方向は、上向きになります。
スライドガラス位置
標本がカバーガラスに取り付けられている場合、対象物からスライドガラスまでの距離は、おそらく、画像の外側の 50 ～ 100 ミクロンの範囲にあります。 この場合、またはスライドガラスがない場合は、右上のセレクターで「Far away」を選択します。
- スライド位置が「Close to object」に設定された Coverslip エディタ。 スライドは、縞模様のボックスで示されます。
標本がスライドガラスに近いか、またはマウントされている場合は、「Close to object」を選択します。 カバーガラスを適切な場所にドラッグします。 この場所がデータから離れている場合は、縮小する必要がある場合があります。 マウス右ボタンを押したままにすると、画像をドラッグできます。 イメージング品質の観点から、封入溶媒と液浸媒質の間に屈折率の不一致がある場合、これは、理想的な状況ではありません、これは、対物レンズから出入りする光が封入溶媒を通って何百もの波長を移動する必要があり、強い球面収差が発生する可能性があるためです、PSFの膨張を誘発します。