点像分布関数 (Point Spread Function)
蛍光顕微鏡では、取得した画像は、常に顕微鏡下の実際の対象物のぼやけた表現です。 このぼやけは、いわゆる点像分布関数（PSF）によって記述されます。 PSF は、オブジェクト内の 1 点が画像でどのように見えるかを表します。
光学顕微鏡での結像プロセスは、線形です。2 つの対象物 A と B が同時に画像化されると、結果は、個別に画像化された対象物の合計に等しくなります。 この線形特性の結果として、任意の対象物の画像は、対象物を小さな部分に分割し、これらのそれぞれをイメージングし、その後、結果を合計することによって計算できます。 対象物をますます小さな部分に分割すると、最終的には無限に小さな点対象物の集まりになります。 これらの各点対象物は、画像内に PSF を生成し、対応する点の位置と強度にそれぞれ移動およびスケーリングされます。 したがって、結果として得られる画像は、(多くの場合、重複する) PSF の収集です。 この結像プロセスは、畳み込み方程式によって数学的に表されます。 イメージングセットアップの PSF で畳み込まれた対象物は、取得された画像を提供します。
PSF は、画像内の点がどのようにぼやけているかを明らかにするため、光学システムの品質の有効な尺度です。 PSF は、常に正規化されている（つまり、そのスパン全体の積分は、1 に等しい）ため、異なるシステムの PSF を比較して、それらの画像品質を比較するのは簡単です。
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Huygens PSF Distiller
Huygens PSF Distiller を使用すると、デコンボリューションの結果を改善し、システムの品質評価を実行するために使用できる顕微鏡固有の点像分布関数（PSF）を見つけることができます。Distiller ウィザードは、ビーズサイズを補正し、入力ビーズ画像からノイズを除去します。 Huygens 測定した PSF は、生のビーズ画像よりもデコンボリューションに適したものになります。
Huygens PSF Distiller
Huygens PSF Distiller を使用すると、デコンボリューションの結果を改善し、システムの品質評価を実行するために使用できる顕微鏡固有の点像分布関数（PSF）を見つけることができます。Distiller ウィザードは、ビーズサイズを補正し、入力ビーズ画像からノイズを除去します。 Huygens 測定した PSF は、生のビーズ画像よりもデコンボリューションに適したものになります。
Huygens PSF Distiller
理論上の PSF（左図）または、測定された PSF（右図）でデコンボリューションされたナノビーズ STED（緑色）およびコンフォーカル（赤色）画像の最大強度投影。 理論上の PSF でデコンボリューションされた画像では、2 つの近接したビーズ間の分離は示されませんが（矢印で示されます）、測定された STED PSF を使用すると、約 65 nm の間隔で配置された 2 つのビーズが分離されます。
デコンボリューション
PSF がわかっている場合は、取得した顕微鏡画像をデコンボリューションによって真の対象物に近づけるために使用できます。 デコンボリューションは、イメージングの畳み込みを反復的に逆にします。 対象物のモデルが作成され、それを PSF で畳み込み、結果を実際の画像と比較することによって、反復的に改善されます。 プロセスの最後に、対象物のモデルは、真の対象物を正確に表現したものになり、取得した画像に比べて解像度と信号対ノイズ比が改善されます。 特に、デコンボリューションは、重複する PSF を使用して隣接する粒子を再分離できますが、これは、単純なブレ除去操作では不可能です。PSF は、顕微鏡画像が「構築」される基本的な「レンガ」であるため、利用可能なすべての情報を収集するには、少なくとも PSF のスケールで詳細を記録する必要があります。 デコンボリューションは、PSF スケールで機能するため、そうしないとデコンボリューションの試みが台無しになります。 この概念から、ナイキストレートとして知られるサンプリング基準に従います。
マルチチャネル画像では、PSF がチャネル間で異なることが多いため、デコンボリューションにマルチチャネル PSF が必要です。
デコンボリューションの目的は、 PSF の知識と取得した画像を使用して真の対象物を見つけることです。
理論 PSF
PSF の形状は、顕微鏡の種類と使用される顕微鏡パラメータによって異なります。 これらがわかっている場合は、モデルのイメージング条件に基づいて理論上の PSF を計算できます。 この PSF は、デコンボリューションに使用できます。2 つの重要なパラメータは、使用されるレンズ媒質と封入媒質の屈折率（RI）です。 これは、2 つの間の不一致により PSF が歪むためです。 この歪みは、（カバーガラスに関して）イメージング深度に依存します。 サンプル内でより深く移動するにつれて、画質は、徐々に悪化します（PSF は、大きくなります）。 したがって、理論上の PSF をデコンボリューションに使用する場合は、異なる取得深度に対して異なる PSF を計算することにより、深度に依存する方法でそれを計算することが重要です。
PSF 形状に対する屈折率 (RI) の不一致の影響
レンズ媒質としてオイル（RI = 1.51）を使用した場合の Huygens で生成したコンフォーカル PSF。 ボタンをクリックして、封入媒質の RI を 1.51（RI の不一致なし）から 1.00（強い不一致）に変更します。
1.51（RI の不一致なし）と 1.40 の間では、あまり何も起きていないことに注意してください。 ただし、封入媒質の RI が 1.4（対物レンズの NA）を下回ると、PSF は、さらに大きく変化し始めます。これは、対物レンズの NA が封入媒質の RI によって効果的に制限されるためです。 これは、その軸に沿って PSF を効果的に伸ばす内部全反射によるものです。
PSF 形状に対する RI ミスマッチとイメージング深度の影響
オイル（RI = 1.51）をレンズ媒質として、水（RI = 1.33）を封入媒質として使用した場合の Huygens で生成した PSF。 ボタンをクリックして、PSF に対する（カバーガラスの位置に対する）イメージング深度の影響を確認します。
屈折率の不一致により、PSF は、軸方向により長くなり、非対称になります。 歪みは、深さとともに増加します。 示されている PSF 非対称性は、レンズ屈折率が媒質屈折率よりも大きい顕微鏡セットアップの典型です。 より滑らかな部分は、カバーガラスの側面にあり、ピークと二次最大値でさえより深い終わりにあります。 このパターンは、レンズ媒質 RI が封入媒質 RI よりも小さい場合に反映されます。
顕微鏡の種類
PSF の形状は、画像取得に使用される顕微鏡の種類によって異なります。 下の名前をクリックして、対応する理論上の PSF がどのように見えるかを確認してください。 図中のスケールバーは、異なるサイズを示していることに注意してください。コンフォーカル PSF の特性は、使用するピンホールに大きく依存します。 ピンホールの直径が小さいと、高い画像解像度が得られますが、シグナルが犠牲になります。コンフォーカル画像は、ピンホールがサンプル光の大部分をブロックするため、通常、SNR が低くなります。
コンフォーカルデコンボリューションの詳細については、ここをクリックしてください。
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回転ディスクコンフォーカル PSF の形状は、従来のコンフォーカルシステムの形状に似ています。 ただし、回転ディスクコンフォーカル顕微鏡では、複数の回転ディスク通過でポイントが継続的に照射されるのではなく、非常に短い時間だけ照射されます。 露光量が減ると、従来のコンフォーカルに比べて SNR が低下します。 したがって、デコンボリューションの場合、2 つの方法の PSF は、類似していますが、SNR は、異なる設定にする必要があります。
回転ディスクデコンボリューションの詳細については、ここをクリックしてください。
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再スキャン顕微鏡（RCM）システムの PSF は、従来のコンフォーカル顕微鏡よりも √2 倍小さい半値幅（FWHM）を持っています。 この解像度の増加は、中程度から大きいピンホール径にも当てはまり、再スキャン顕微鏡（RCM）画像の SNR が高くなります。
再スキャンデコンボリューションの詳細については、ここをクリックしてください。
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ドーナツ型の STED ビームによる抑制により、STED PSF は、従来のコンフォーカル顕微鏡よりも狭くなり、横方向（x および y）の解像度が高くなります。 ただし、STED 画像は、通常、従来のコンフォーカル画像よりもノイズが多くなります。 z 方向の解像度も向上させるために、3D STED が開発されました。 ここでは、追加のデプリーションビームが PSF を軸方向に抑制し、中央に小さなスポットだけを残します。
STED デコンボリューションの詳細については、ここをクリックしてください。
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サンプル内のある点での励起シート光の厚さは、この点が画像の軸方向にどの程度ぼやけているかを決定します。 したがって、PSF のサイズは、画像の横方向の位置に依存します。
シート光デコンボリューションの詳細については、ここをクリックしてください。
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実験 PSF
理論上の PSF は、モデルのイメージング条件に基づいて計算されます。実際には、すべての顕微鏡セットアップには、PSF の形状を変化させるいくつかの固有の物理的偏差があります。これらのセットア ップ固有の収差を補正するには、特定のイメージングセットアップでの測定から得られた実験的な PSF をデコンボリューションに使用する必要があります。これらは、点対象物のように動作するため、サブ解像度の球状ビーズの画像からセットアップ固有の PSF を見つけることができます。 ただし、真の点対象物とは異なり、ビーズのサイズは、有限（ゼロ以外）です。 したがって、ビーズ画像を PSF として直接使用するよりも、最初にビーズサイズを補正する方が正確です。 さらに、ビーズ画像には、フォトンノイズが含まれますが、真の PSF には含まれません。したがって、PSF を測定するときは、ノイズ補正も必要です。
PSF の抽出の詳細については、ビーズの記録のページをご覧ください。
上図： 理論（左図）と測定（右図）広視野 PSF の MIP。下図： 理論（紫色、点線）および測定（黄色）PSF の中心を通るライン強度プロファイル、プロットは、同じ縮尺ではありません。
品質評価
顕微鏡の結果について議論するときは、使用した取得セットアップの品質を考慮することが重要です。この重要性は、例えば、QUAREP-LiMi イニシアチブの形成と急速な成長によって示されています。 顕微鏡の物理的なズレは、画像の再現性に影響を与えるため、評価することが重要です。 そのためには、顕微鏡の種類やブランドに関係なく、一貫した品質測定が必要です。 実験的な PSF は、使用された顕微鏡によって点対象物がどのようにぼやけるかを示すため、このような尺度の有効な例です。 理論上のPSF と比較すると、モデルのイメージング条件からの偏差が明らかになり、異なるセットアップの PSF を比較すると、どれが最も強い収差を誘発するかがわかります。 これらの PSF 比較は、PSF を視覚的に検査することによって定性的に、または半値幅（FWHM）値を比較することによって定量的に行うことができます。理論的対実験的
理論上の PSF と比較すると物理的な偏差が明らかになるため、実験的な PSF は、顕微鏡の品質の有効な尺度です。 したがって、イメージングの前に、特に、新しいセットアップの場合は、常に PSF を測定することをお勧めします。 測定された PSF が理想的なモデルからの逸脱を示している場合、顕微鏡技師は、画像取得前にセットアップを調整するか、さらに画像処理を行う前に測定された PSF で画像をデコンボリューションするかを選択できます。油浸レンズを使用して水のようなサンプルを撮像する場合など、強い屈折率の不一致で撮像する場合は、特に注意が必要です。 PSF は、測定された PSF を使用する場合には考慮されない異なるイメージング深度に対して異なります。 理論上の PSF は、深度に依存する方法で計算できます。 したがって、このような場合は、イメージング設定を最適化し、その後、取得した画像を深度依存の理論的 PSF でデコンボリューションすることをお勧めします。
Huygens ソフトウェアでは
Huygens は、画像パラメータから正確に計算された理論上の PSF と、Huygens PSF Distiller を使用してビーズ画像から抽出された測定 PSF の両方のデコンボリューションを提供します。 PSF は、画像を復元するために現在、存在する最も高度なアルゴリズムに供給されます。Huygens ソフトウェアがデコンボリューションを行う方法の詳細については、Huygens Deconvolution を参照してください。
理論 PSF
Huygens ソフトウェアは、高度なベクトルベースの EM 回折理論を使用して理論上の PSF を生成します。これは、後でデコンボリューションに使用できます。 PSF 生成アルゴリズムは、完全にマルチスレッド化されており、最大の PSF もサポートできます。 Huygens は、広視野、コンフォーカル、回転ディスク、マルチフォトン、シート光、STED、単一分子ローカライゼーション、アレイ検出器、再スキャン、4Pi など、さまざまな顕微鏡タイプ用に PSF を生成できます。顕微鏡パラメータが正しく設定されている場合（メタデータから自動的に、またはユーザーがマニュアルで）、Huygens ソフトウェアは、理論上の PSF でデコンボリューションするときに球面収差を自動的に補正します。 これは、異なるイメージング深度に対して異なる PSF を使用することによって行われます。 これらの深度依存 PSF を計算するために、PSF 生成は、カバーガラスの位置、イメージング方向、およびレンズと封入媒質の屈折率（RI）を使用して、深度依存 PSF を生成します。独自の varPSF オプションを使用すると、Huygens は、MLE アルゴリズムの各反復時に、複数の異なる PSF を同時に適用して、さらに正確な球面収差補正を行うこともできます。
Huygens Professional を使用すると、理論上の PSF を視覚化して解析することができます。 顕微鏡パラメータの任意のセットについて、オペレーションウィンドウのタスクバーにある「Theor.PSF」ボタンを使用して、理論上の PSF の 3D 画像を生成できます。 または、画像（例えば、ImageA）からの PSF は、コマンドを使用して tcl コマンドシェルから生成できます。
ImageA genpsf -> psf0 μm（左図）および 20 μm（右図）の深さでの XY（上図）および XZ（下図）の Huygens によって生成された理論上のコンフォーカル PSF の MIP。 屈折率の不一致により、Z が非対称になります。
PSF 抽出
Huygens PSF Distiller を使用して、実験的な PSF を見つけることができます。 ビーズを平均化し、有限のビーズサイズとフォトンノイズの存在を補正することにより、Distiller は、正確で高い SNR PSF を抽出できます。 この実験的な PSF は、顕微鏡の品質評価だけでなく、セットアップに最適化されたデコンボリューションにも使用できます。Huygens を使用した実験的 PSF の抽出に関する包括的な議論については、ビーズの記録を参照してください。