Back-projected pinhole Radius

ピンホールは、コンフォーカル顕微鏡でレンズの像側に使用される小さな穴で、焦点が合っていない光を取り除き、実際の 3D 画像を記録できるようにします。

Huygens デコンボリューションアルゴリズムは、物理的なピンホールのサイズを使用しません（点像分布関数 PSF を計算することによって）システムを適切にモデル化するために関連するのは、サンプルに逆投影されたピンホールの画像のサイズです。Huygens ソフトウェア全体を通して、コンフォーカル顕微鏡と ニポーディスク顕微鏡のピンホールサイズは、ナノメートル 𝑟 𝑏 単位の逆投影半径として指定されています。

逆投影されたピンホール半径を使用すると、均一な参照が確立され、さまざまな顕微鏡モデルのイメージング設定に関するあらゆる種類の複雑さが回避されます。 PSF の観点からは、重要なのはサンプル上のピンホールの画像であり、この投影が技術的にどのように達成されるかではありません。

逆投影ピンホール半径の計算

逆投影とは、標本面に現れるピンホールのサイズを意味します： 物理的なピンホールのサイズ 𝑟_{𝑝ℎ𝑦𝑠} を検出システムの合計倍率で割ったものです。 この合計倍率は、（可変）対物レンズ倍率と固定内部倍率の積です：

$$ r_b\ =\ \frac{r_{\text phys}}{m_o\ m_{\text sys}} $$ (Eq. 1)

ここで、m_o は、対物レンズの倍率、m_sys は、システムの固定倍率です。

Huygens のマニュアルにあるさまざまな顕微鏡の方程式は、ユーザーが逆投影された値を見つけられるようにすることを目的としていますが、考え方は、常に、同じです： 実際のピンホールの直径が与えられた場合、単位変換には倍率（直径ではなく、半径を nm 単位で取得するため）、および顕微鏡の倍率を考慮したいくつかの分割数が必要です。 これらには、対物レンズと固有のシステム倍率の両方が含まれます。 円形以外のピンホール形状を持つ一部の顕微鏡では、幾何学的な補正も必要になる場合があります。

セットアップの正しい値を見つけるのに役立つオンラインの Backprojected Pinhole Calculator があります。

逆投影ピンホールの単位としてのエアリーディスク

一部のコンフォーカル顕微鏡は、エアリーディスク（直径）を単位としてピンホールサイズ（直径）を報告します。 逆投影されたピンホール半径は、次のように計算できます：

$$ r_b\ =\ N_{Ad}\ 0.61\ \frac{\lambda_{ex}}{\text NA} $$ (Eq. 2)

N_Ad は、エアリーディスクの数値、NA は、レンズの開口数、λ_ex は、励起波長です。 エアリー回折パターンは、放射光によって形成されるため、原則として λ_ex を使用することは、正しくありません。 ただし、顕微鏡メーカーは、励起波長の方がより明確に定義されており（単色であり、蛍光波長のようなスペクトルを持たない）、調整可能なバンドフィルターなどのデバイスの設定に依存しないため、励起波長を使用することを好むと思われます。 このため、上記の式では、λ_ex も使用します。

場合によっては、固定基準波長を使用することさえあります!!! 例えば、ライカは、エアリー単位で測定されるすべての大きさで 580 nm を使用します。 これは、顕微鏡について知っておく必要があることです。

（この関係は、内部システムとレンズの倍率を知る必要がないことに注意してください。式 2 と式 1を組み合わせて、レンズの倍率を考慮して、エアリーディスク単位でピンホールのサイズを指定すると、ピンホールの物理的なサイズを取得できます）。

顕微鏡は、実際には、1 つのエアリーディスクを取得するために、チャネルごとに異なるピンホールを使用する場合があります（エアリーディスクの実際のサイズは、放射光の波長に依存するためです!!!）。 しかし、多くの顕微鏡は、実際には、すべてのチャネルに同じピンホールを 1 つだけ
使用します。この場合、すべてのチャネルに対して 1 つの エアリーディスクが使用されるということは、もはや事実ではありません。 このような顕微鏡は、通常、チャネルごとの実際の λ_ex ではなく、固定の λ_ex を参照として使用して N_Ad を報告します。

したがって、デコンボリューションを行うための理論的な PSF を計算するには、設計されたピンホールの正確な波長を知る必要があります。 さらに、光学媒体の屈折率も関係があります、これは、波長が変化するためです、そのため、メーカーがピンホールサイズを与える際に、これを考慮しているかどうかを知る必要があります。 最後に、エアリーディスク単位を使用することは、あまり良い考えではありません、なぜなら、顕微鏡内で実際に何が起こっているのかについて多くの不確実性をもたらすからです...

ピンホールの計算の難しさおよび逆投影ピンホール計算機を参照してください。