Light Sheet Deconvolution

Huygens は、広範囲のシート光蛍光顕微鏡（LSFM）セットアップとさまざまなタイプのシート光をサポートしています。 シート光の形状と強度分布は、さまざまであり、これは、画質を決定する重要な要素です。 例えば、シングルガウスビームの形状は、視野（FOV）が大きくなるように調整できますが、シートの厚さが増すため、軸方向の分解能が低下します。 大きな FOV で高解像度と薄いシートを維持するには、ガウスシートを伝搬方向に沿って移動するか（2）、ベッセルビームスキャニングシート光などの代替シート光を使用することができます（3）。

Huygens の汎用性の高いシート光デコンボリューションオプションには、シート光の種類とシート光内の PSF 変動の両方が考慮されるため、最適な結果を提供する点像分布関数（PSF）モデルが含まれています。 最適な PSF モデルを構築するために必要なシート光顕微鏡固有のパラメータは、画像ファイルから読み込まれ、顕微鏡パラメータエディタで簡単に調整することもできます。 以下に説明します。 マルチビュー画像のさらなるスティッチングとフュージングについては、Huygens Stitcher と Huygens Fuser を参照してください。

画像説明： 格子シート光画像の歪み補正とデコンボリューション。 乳癌細胞（細胞株 SUM159）の歪んだ画像は、OX-GFP にリンクされた ER マーカーと、主に脂肪滴に局在するサイトゾルタンパク質を発現し、ディザ処理されたマルチベッセルビーム格子シート光システムで取得されました。 画像は、Huygens Object Stabilizer で歪みが補正されました。 生およびデコンボリューションされた小胞体シグナルの MIP（それぞれに、A および B）とそれに対応する拡大（A' および B'）は、デコンボリューション後の細胞周辺および核に近い、より明確な網状 ER パターンを示しています。 パネル A' のラインは、強度プロファイルが生成された生の画像とデコンボリューションされた画像の位置を示します（C； 生画像、破線なし； デコンボリューション後の画像、破線）。 パネル D は、脂肪滴の周りのリングに局在するマーカーの MIP を示しています。 これらのリングは、生の画像 （D'）の単一の断面では、見分けるのが難しいのに対し、デコンボリューションは、その外観をより明確にします（E）。 D' のラインの強度プロファイルは、デコンボリューション後のシグナル（2 倍以上）と解像度（1.5 倍以上） の増加を示しています（F； 生画像の破線なしの線； デコンボリューション後の破線）。 スケールバーは、マイクロメートル単位です。

シート光顕微鏡パラメータ

Huygens LSFM デコンボリューション用の画像を準備するには、最初に画像データの顕微鏡パラメータを確認することをお勧めします。 画像のメタデータにこれらのパラメータに関する情報が含まれている場合、Huygens は、それらをパラメータテンプレートに組み込みます。

シート光励起モード

シート光励起モードでは、使用したシート光タイプを指定します。 選択したシート光タイプに適用される顕微鏡パラメータだけが表示されていることに注意してください。

• ガウスシート光。 シリンドリカルレンズ、または励起の入射瞳でのフィルファクターが低いスキャンビームを使用する LSFM システムに適しています。 LaVision UltraMicroscope および Zeiss Z1 顕微鏡などのシステムは、このモードを使用できます。
• ガウスマルチビューシート光。 「ガウスシート光」と同様ですが、反対側から同時に照明します。
• ガウスフラットシート光。 シリンドリカルレンズ、またはスキャンビームを使用する LSFM システムに適しており、励起の入射瞳でのフィルファクターが低く、視野全体の軸方向解像度を向上させる目的でシート方向に沿ってビームウエストを移動します。
• 高いフィルファクター、スキャンビーム。 スキャンビームを使用してシート光を形成し、励起レンズの入射瞳が一杯になる LSFM システムに適しています。 Leica Digital Light Sheet などのシステムは、このモードを使用できます。
• スキャンベッセルビーム。 このオプションは、スキャンベッセルビームを使用して、シート光を形成する LSFM システムに使用します。 マルチフォトン励起パラメータが調整されている場合、Huygens は、マルチフォトン照明も考慮することができます。
• スキャンベッセル格子。 このオプションは、スキャンベッセル格子を使用してシート光を形成する LSFM システムに使用します。 マルチフォトン励起パラメータが調整されている場合、Huygens は、マルチフォトン照明も考慮することができます。
• 高いフィルファクター、円柱。 シリンドリカルレンズを使用して、シート光を形成する LSFM システムに適しており、入射瞳で高いフィルファクターを使用します。

ガウスシートの幅

このパラメータは、「Gaussian light sheet」および「Gaussian MultiView light sheet」モードでだけ表示されます。 シートの幅（厚さ）をマイクロメートル単位で指定します。 ガウスプロファイルの幅は、値が次のピーク値の式に等しい 2 点間の距離として定義されます。 半値幅値をこのビームの全幅に変換するには、それに 1.7 を乗じます。

シート光の開口数

励起レンズパラメータの開口数（NA）は、「High fill factor, scanning beam」、「Scanning Bessel beam」、「Scanning Bessel lattice」、および「High fill factor, cylinder」モードで表示されます。 検出レンズの NA は、（メイン）光学パラメータで指定されていることに注意してください。 励起レンズの NA またはそのフィルファクターが不明であるが、有効な NA がわかっている場合は、次の手順に従います：

• シート光 NA を実効 NA の 4 倍に設定
• フィルファクターを 0.25 に設定

シート光フィルファクター

このパラメータは、「High fill factor, scanning beam」および「High fill factor, cylinder」モードにだけ適用されます。 値は、励起（LSFM）レンズのフィルファクターを示します。 フィルファクターは、ビーム幅と対物瞳の直径の比率です。 Huygens のデフォルト値は、「0.5」です、これは、照明ビームが LSFM レンズの対物瞳の半分の幅であることを意味します。

シート光フォーカスオフセット

この値は、シート光が検出レンズの焦点からどれだけ下（負の値）、または上（正の値）にあるかを定義します。 このパラメータは、画像ファイルから読み取ることはできません。 デフォルト値は、「0」です、これは、適切に調整されたシステムでの最適値です。

シートの横方向のオフセット

励起レンズの焦点と検出レンズの光軸間の距離を指定します。 負の値は、シート光の「中央」が励起レンズに向かって移動していることを示します。 正の値は、励起レンズからの移動を示します。 通常、この値は、画像ファイルから読み取られません。 適切に位置合わせされたシステムでは、この値は、ゼロに等しくなります。 ただし、これは、画像がトリミングされている場合、または光学設定でこれを変更できる場合、または単純に適切に調整されていない場合には、異なる場合があります.

シート光方向

このパラメータは、励起対物レンズが検出レンズに対して配置される位置を定義します。

• 右から
• 上から
• 左から
• 下から

散乱パラメータ

Huygens は、PSF を調整することでサンプルの散乱に対処できます。 散乱補正は、顕微鏡パラメータウィンドウ内の散乱パラメータ起動ボタンを使用して最適化できます。 ここでは、散乱モデル（均一指数、均一ガウス、および 1D X 方向指数）、蛍光の自由パスの長さ（ミクロン単位）、および散乱しない直接光に関する散乱光の割合を調整できます。 サンプルの散乱特性を先験的に知ることは、ほとんど不可能であるため、散乱補正の有効性は、経験的に決定する必要があります。

デコンボリューションの最適化

あらゆる種類の画像取得と同様に、ナイキストサンプリングは、画質とデコンボリューションの有効性に影響を与える最も重要な要素の 1 つです。 シグナル強度よりもこの取得設定を優先し、イメージングを開始する前に、オンラインの SVI 社の Nyquist Calculator を参照してください。 また、クリッピングを防ぎ、画像のゼロ、または最大値を避けてください。 顕微鏡画像パラメータを正しく設定し（上記を参照）、デコンボリューションを適用する場合は、CMLE アルゴリズムを使用し、褪色補正を無効にし、最初に Acuity 設定を調整してデコンボリューションを最適化します。 これで満足のいく結果が得られない場合は、SNR 値を調整できます。

参考文献

1. Hildebrand, S., Schueth, A., Wangenheim, K.v. et al. (2020). hFRUIT: An optimized agent for optical clearing of DiI-stained adult human brain tissue. https://doi.org/10.1038/s41598-020-66999-3 Huygens PSF distiller、デスキュー用の Object Stabilizer、およびデコンボリューションをシート光データの復元に使用しました。

2. Düring D, Diales Rocha M, Dittrich F, Gahr M, Hahnloser R (2019). Expansion Light Sheet Microscopy Resolves Subcellular Structures in Large Portions of the Songbird Brain. https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00002 Huygens デコンボリューションは、拡張顕微鏡およびシート光イメージングと組み合わせて使用されました。

3. Stelzer, E.H.K., Strobl, F., Chang, BJ. et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Primers 1, 73 (2021). https://doi.org/10.1038/s43586-021-00069-4

4. Liang Gao, "Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet," Opt. Express 23, 6102-6111 (2015)

5. Fahrbach, F., Simon, P. & Rohrbach, A. Microscopy with self-reconstructing beams. Nature Photon 4, 780–785 (2010). https://doi.org/10.1038/nphoton.2010.204