Huygens PSF Distiller
品質評価と最適なデコンボリューション結果を得るためにセットアップ固有の PSF を測定
PSF Distiller を使用すると、顕微鏡固有の点像分布関数（PSF）を見つけることができます、これを使用 して、デコンボリューション結果を改善し、システムの品質評価を実行できます。 Distiller ウィザー ドは、ビーズサイズを補正し、入力ビーズ画像からノイズを除去し、これにより、Huygens が測定した PSF は、生のビーズ画像よりもデコンボリューションに適しています。
測定された PSF は、サブ解像度のビーズを記録し、3D 画像を Distiller にロードすることによって取 得されます。 次に、Distiller は、ビーズの有限サイズを補正し、ノイズを除去し、そして、複数のビ ーズの場合は、使用可能なすべてのビーズの平均を取ります。 結果として得られる PSF には、理想的 な（モデル）PSF にはないシステムに固有の収差が含まれているため、デコンボリューション時に、こ のような収差を補正できます。 測定された PSF は、理論（理想的な）PSF か、または他のラボの顕微 鏡の実験 PSF と簡単に比較してできるため、顕微鏡の品質評価も可能にします。
測定された PSF は、サブ解像度のビーズを記録し、3D 画像を Distiller にロードすることによって取 得されます。 次に、Distiller は、ビーズの有限サイズを補正し、ノイズを除去し、そして、複数のビ ーズの場合は、使用可能なすべてのビーズの平均を取ります。 結果として得られる PSF には、理想的 な（モデル）PSF にはないシステムに固有の収差が含まれているため、デコンボリューション時に、こ のような収差を補正できます。 測定された PSF は、理論（理想的な）PSF か、または他のラボの顕微 鏡の実験 PSF と簡単に比較してできるため、顕微鏡の品質評価も可能にします。
理論 PSF （左図）または測定された PSF （右図）でデコンボリューション処理されたナノビーズの STED（緑色）およびコンフォーカル（赤色）画像の最大強度投影画像。 理論 PSF でデコンボリューション処理された画像は、2 つの近接したビーズ（矢印で示されている）間の分離を示していませんが、測定された STED PSF を使用すると、約 65 nm の間隔で 2 つのビーズが分離されます。 完全な図.
ノイズもバックグラウンドもなし
Distiller は、ノイズの多い画像からでも、バックグラウンドシグナルのないノイズのない PSF を出力します。
PSF 抽出について
点像分布関数（PSF) は、顕微鏡によって画像がどのようにぼやけるかを表します。 真の 対象物と結果の画像の両方がわかっている場合は、PSF を抽出できます。 ビーズの画像にも当てはまります。これは、既知の寸法の蛍光 PSF が抽出されると、画像と組み合わせて、デコンボリューショ ンのプロセスを通じて真の対象物が不明な画像を復元するために使用できます。結像と Huygens の真のデコンボリューションの詳細
直感的なウィザードですばやく簡単に
PSF Distiller ウィザードは、いくつかの簡単な手順で抽出を実行します。 ウィザードは、それぞれが 1 つ以上の蛍光ビーズを含む 1 つまたは複数の画像から PSF を測定できます。 マルチカラービーズ画 像からマルチチャネル PSF を抽出するか、または個別のシングルチャネルビーズ画像の PSF からマル チチャネル PSF を構築することもできます。
Distiller ウィザードの独自の機能により、PSF 抽出が直感的かつ簡単になります。
Distiller ウィザードの独自の機能により、PSF 抽出が直感的かつ簡単になります。
- 適切なビーズを選択します。 ウィザードは、色分けされた画像オーバーレイを使用して、どの ビーズに問題がなく、z 位置がずれているか、疑わしい強度があるか、光軸から離れすぎている か、隣接するビーズまたは端に近すぎるかを示します。 問題のないビーズだけが抽出に使われ ます。
- ビーズ全体の積算と平均化。 ウィザードは、一度に複数のビーズ画像を受け入れ、それぞれか ら適切なビーズを抽出し、それらを積算して平均化することができます。 高い SNR データの 場合、適切な PSF 抽出には単一のビーズ画像で十分な場合があることに注意してください。
- 半値幅を自動的に評価します。 PSF FWHM Estimator は、3 次元すべてで PSF の中心を通る ライン強度プロファイルを作成します。 それぞれについて、最大強度値の半分でのプロファイ ルの幅が測定されます。 ユーザーは、これを線形的に行うか、または利用可能な曲線近似手順 の 1 つを介して行うかを選択できます。半値幅は、PSF が広いほど画像のぼやけが大きくなるため、顕微鏡の品質を定量化します。
米国、CalTech の Say-Tar Goh からのビーズデータ。
上部には、広視野画像の理論 PSF（左図）および測定 PSF（右図）の MIP を表示しています。 測定 された PSF は、170 nm ビーズの画像から抽出され、完全に取得されました（正しいサンプリングレー ト、クリッピングなし）。下に、各次元の理論 PSF（紫色、点線）および測定 PSF（黄色）の中心を通 るライン強度プロファイルを示します。 3 つのプロットは、同じスケーリングにされていません。
顕微鏡品質評価
Huygens PSF Distiller は、定性的および定量的な顕微鏡品質評価の両方を自動的に可能にします。すべての顕微鏡は、理想的なモデルからの独自の逸脱があるという点で独特です： 2 つの対物レンズが 完全に同一であるということはなく、配置が異なる等の可能性があります。 これは、結果画像の品質 評価と再現性に影響を及ぼします。 したがって、サンプル調製と画像取得条件に関する情報に加えて、 実際の顕微鏡の品質の測定が必要です。 このような対策を含めることの重要性は、QUAREP-LiMi（光 学顕微鏡における機器と画像の品質評価と再現性）取組みの構成と急速な成長によって示されています。 PSF は、点対象物が顕微鏡によってどのようにぼやけているかを示すために、有効な顕微鏡品質測定を 提供します。 Distiller ウィザードに統合された FWHM Estimator は、品質の定量的測定を提供しま す； 出力 PSF は、例えば、Twin Slicer を使用してすべての次元で理論 PSF と比較することにより、 定性的評価を可能にします。
記録する設定を変更した後に、および光学機器か、またはスキャン装置を修理した各メンテナンス作業 の後に、PSF を測定することをお勧めします。測定された PSF は、物理的な既知の対象物（ビーズ）を顕微鏡が実際に測定したもの（ビーズ画像）と関連付けるという意味で顕微鏡のキャリブレーションとして機能します。
STED PSF
Huygens PSF Distiller では、堅牢な STED 熱ドリフト補正を統合し、これにより、STED 画像によく見られる熱ドリフトを自動的に補正できます。さらに、PSF Distiller の最終ステージで、ユーザーは、抽出された PSF から STED パラメータを評価することを選択できます。高度な反復ア ルゴリズムは、抽出した PSF で最良の理論 STED イメージングパラメータを評価し、適合させ、実際 のイメージング状況を反映するより堅牢な理論 PSF 評価を可能にします。STED PSF を測定するには、折り紙ナノキューブ（例えば、これらの GATTA ビーズ）を使用すること をお勧めします。これらのサブ解像度の対象物（STED の場合は、< 40 nm）には、多くの色素分子 を詰め込むことができるため、同じサイズの薄暗くて褪色しやすいビーズよりも適合しやすくなります。
アムステルダムの VUmc で Leica TCS SP8 STED 3X で測定された GATTA-Beads R の 3D スタック。Scientific Volume Imaging による 3D PSF 抽出およびレンダリング。
研究に使用
Emanuele Roscioli、Tsvetelina E. Germanova、Christopher A. Smith 等。 人間の動原体のアンサンブルレベルの組織と異なった伸張および付着センサーの根拠。PSF Distiller の PSF は、回転ディスク画像のデコンボリューションで使用されました。
Cell Rep. 31 (4) (2020).
Sven Hildebrand、Anna Schueth、Klaus von Wangenheim 等。 hFRUIT： DiI で染色された成人の脳組織を光学的に透明にするための最適化された薬剤。
PSF Distiller とデスキューイングを使用して、シート光データを復元しました。
Sci Rep 10, 9950 (2020).
詳細については、Scientific Publications を参照してください。
関連製品
例えば、サンプルステージの不安定性または熱ゆらぎによる 3D 断面間の不整合は、PSF 抽出の前に、Huygens の Object Stabilizer で補正する必要があります。 STED イメージングの場合、 Distiller の特別な STED 設定で実験 PSF を見つけた後に、Huygens STED デコンボリューションを使用して画像を確実にデコンボリューション処理できます。Object Stabilizer STED Deconvolution
詳細情報
点像分布関数ビーズの記録
サポートページ
PSF Distiller ウェビナー
Huygens PSF Distiller Gallery
PSF 抽出に関連するステップ。 Huygens PSF Distiller は、複数のビーズを含む画像を処理できます（a）。Distiller は、画像の対象物のサイズと分離を考慮して、最適なビーズを自動的に選択します。 これらの選択されたビーズシグナルは、積算されます。積算プロセスは、抽出プロセスに有益な、より高いSNR（b）の平均的なビーズを作成します。 Distiller は、非線形アルゴリズムを使用して、積算されたPSF から PSF を抽出します（c）。 抽出された PSF は、中央に配置され、正規化され、ノイズがないため、デコンボリューションに直接使用できます。すべての画像は、疑似カラーモードの 3D MIP レンダリングです。
ATTO 647N ナノビーズでのデコンボリューションの結果。 すべての画像は、 XY MIP 投影画像です。(a)：コンフォーカル（赤色）と STED（緑色）で画像化された生のデータセット、(b)：測定された PSF でデコンボリューション処理された同じデータセット、(c)：理論 PSF でデコンボリューション処理されたズームイン領域、(d)：測定された PSF でデコンボリューション処理されたズームイン領域、(e)：(c) および（d）の矢印で示された対象物を介した強度プロファイル。理論 PSF でデコンボリューション処理された画像は、2 つの近接したビーズ間の分離を示していませんが、測定された PSF は、約 65 nm の間隔で 2 つのビーズを分離できることを示しています。
ATTO 647N ビーズの理論 STED PSF と測定（抽出）PSF の半値幅。理論 PSF（グレイ色）および測 定された PSF（青色）の X（a）、Y（b）および Z（c）に沿った強度プロファイル。 各強度プロファイルの半値幅も表示されます。 理論 PSF は、Leica LIF メタデータに含まれる STED パラメータに基 づいて計算されます。 特に、強度プロファイルのベースでは、測定された（抽出された） PSF が理論 PSF と比較してはるかに狭く、 X と Y で点像分布関数が狭く、半値幅が小さいことに注意してください。 最終的ではありません： STED レーザーは、最大パワーの 50% で使用されました。