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顕微鏡セットアップのキャリブレーションは、信頼性の高い画像取得と信頼性の高い画像処理にとって 重要です。 既知の対象物から取得した画像を解析することで、顕微鏡が画像の対象物をどのように歪め ているかを知ることができます。 収差がわかれば、これらを補正することができます。 顕微鏡のキャ リブレーションに最も適した対象物は、すべての空間次元で対称であるため、球状のビーズです。

PSF 抽出用の記録ビーズ

ビーズを記録する方法の一般的なアプリケーションは、点像分布関数（PSF）抽出（別名 PSF 抽出または測定） です。 各顕微鏡システムには、対象物からの点が画像でどのように収差するかを表 す独自の特徴的な PSF があります。 この PSF は、球状のサブ解像度ビーズの 3D 画像から決定でき ます： サブ解像度であるため、このようなビーズは、点対象物のように動作し、取得した画像に PSF と して表示されます。

実際には、これはもう少し複雑です。 小さなビーズは、わずかなシグナルしか提供しないため、生のビ ーズ画像は、シグナル対ノイズ比（SNR）が低くなる可能性があります。 これは、通常、代わりに大き なビーズを使用する必要があることを意味します。 これらのビーズは、もはや点状ではないため、それらの画像は、実際の PSF の肥大化した表現になります。 そのため、PSF を抽出する際に有限（ゼロ以 外）のビーズサイズを補正することが不可欠です； 生のビーズ画像を直接使用すると、PSF が過大評価 され、デコンボリューションに使用すると過補正になります。

より大きなビーズを使用する場合でも、単一のビーズ画像には、フォトンノイズが含まれます。 したが って、多くのビーズを使用した PSF Distiller での平均化手順を使用することをお勧めします。

ビーズを選ぶ

ビーズは、その直径が使用される顕微鏡の解像度を十分に下回っている場合にだけ、画像に PSF として 表示されます。 PSF 抽出は、蛍光分子の数、したがって、シグナル強度がビーズのサイズに比例すると いう事実によって複雑になります。 コンフォーカルまたは STED などの低シグナル顕微鏡では、これ は、サブ解像度ビーズには、PSF を確実に抽出するのに十分なシグナルがない可能性があることを意味 します。 ただし、ビーズが大きくなると、点状でなくなるため、実際の PSF の表現が肥大化します。 したがって、すべての顕微鏡タイプについて、顕微鏡の SNR と解像度に基づいて、シグナルとサイズ の要件のバランスを適切にとる適切なビーズを見つけることが重要です。

推奨事項と体験
顕微鏡も蛍光ビーズも常に改良されているため、これらの点は、古くなっている可能性があることに注意してください。

• 100 nm ビーズの明るさが十分でない場合は、200 nm ビーズの使用を検討してください。

• 平均化を使用して画像シグナルを増加させないでください。 フォトンの統計が乱れるためです。これは、ビーズのような低シグナル対象物で特に、問題になります。 フォトンカウンティングまたは積算を含む設定を使用することをお勧めします。

• モノクロのビーズは、マルチカラーのビーズよりも明るく表示されます。 緑色は、早く褪色する傾向があることに注意してください。

• PSF 構造は、波長に依存するため、ビーズ蛍光体の波長は、サンプルの波長と密接に一致する必要があります。

• PSF 再構築のためにマルチカラービーズスキャン（マルチトラックでも）を実行することはお勧 めしません。 マルチカラービーズを使用する場合は、色収差の測定にもクロストー クの可能性があることに注意してください。

• 折り紙ナノキューブ（例えば、これらの GATTA ビーズ）は、STED PSF 抽出に非常に適しています。 これらのサブ解像度対象物（STED では、< 40 nm）には、多くの色素分子を詰め込むことができるため、STED イメージング条件下でも十分に明るくなります。

画像化されたボリューム

Z に沿って記録された平面の数が少なすぎる場合、 PSF を抽出するときに、 「the axial image size is too small」というエラーが表示されます。 このエラーが表示されず、使用可能なビーズが画像に見つから ない場合もあります。

正しい PSF 抽出にとって重要なのは、断面の数（だけ）ではなく、実際に画像化される物理的な総量で す。 良好なビーズ画像には、ビーズの周囲の広い領域からのシグナルが含まれています、これは、結果 として得られる PSF の中央ピークの周囲にぼやけた円錐形が含まれるためです。 このぼやけは、広視 野および低開口数（NA）の画像で特に、大きくなります。 例えば、広視野顕微鏡で 0.95 NA の対物 レンズを使用する場合、PSF は、Z に沿って非常に大きいため、すべての関連情報を登録するには、NA の場合よりも大きなボリュームをこの方向にイメージングする必要があります。 より多くの平面を取得 できますが、ナイキストサンプリング基準を満たしている限り、Z に沿ってサンプリング密度を減らす こともできます。 通常のイメージングの理想的なサンプリングレート（NA に依存）は、ナイキスト計 算機を使用して見つけることができますが、ビーズを記録する場合は、オーバーサンプリングをお勧めします。

計算機に PSF も表示するように依頼すると、実際のボリュームとナイキストレートで画像化したときのサンプル数の両方で、予想される大きさを知ることができます。 ただし、PSF の端にある低強度領域は、ノイズの影響を強く受けすぎて確実に画像取得できないため、Z に沿って記録できる平面は、そこに示されているよりも少ない（または、記録する必要がある）ことに注意してください。

例： 1.3 NA の典型的な広視野顕微鏡の場合、ビーズは、Z に沿って少なくとも ~ 12 μm をカバーす る 3D 画像に記録する必要があります。 200 nm での 50 - 100 セクションは、ナイキスト基準を 満たします。 NA が 0.95 の場合、画像は、Z 方向に大きくなり、少なくとも ~ 21 μm をカバーす る必要があります。 ただし、Z に沿った理想的なサンプリングレートも同様に大きく、約 700 nm で す。 500 nm ごとに 1 つの平面を使用して、オーバーサンプリングを使用してビーズを記録する場合、 必要なボリュームをカバーするには、42 枚の平面が必要です。 したがって、NA = 0.95 の場合に必要 なボリュームは、NA = 1.3 の場合よりも多くの平面を記録することなくカバーできます。

ビーズ密度

画像のビーズ密度が 20 µm x 20 µm 領域あたり 10 個のビーズよりもはるかに多い場合、それらが互 いに近すぎる可能性があります。 その後、ぼやけた画像が重なり合い、PSF を解き放つことができなく なります。PSF Distiller は、互いに近すぎるビーズを除きます。 「reduce PSF size」パ ラメータを使用してその基準を緩和することはできますが、これが適切に機能するには制限があります。

手順概要

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色収差補正用のビーズ記録

マルチチャネルイメージングシステムは、チャネル間の移動、回転、およびスケーリングの違いとして 画像に現れる色収差の影響を受けることがよくあります。 これらの収差を測定し、補正す るには、既知のマルチカラー対象物の画像を記録する必要があります。 マルチカラービーズは、この目 的に適しています： 実際の対象物（ビーズ）では、すべての色が完全に重なり合うため、画像に見られ る位置ズレは、画像アーティファクトです。 したがって、ビーズ画像を使用して、使用される顕微鏡シ ステムの収差パラメータ、例えば、x 方向の赤色と緑色のチャネル間の移動を測定できます。 これらの パラメータは、同様の条件下で撮影された画像の収差を補正するために使用できます。

より正確な補正のために、色収差補正の前にデコンボリューションを実行することをお勧めします（デコンボリューションによって明らかになったより細かい画像の詳細に基づく）。

Huygens の色収差補正

すべてのタイプの色収差は、Huygens Chromatic Aberration Corrector で補正できます。 入力画像を受け取った後、コレクターは、チャネル間の移動、回転、スケーリングの違いを自動的に評 価できます。 グラフィックユーザーインターフェースは、元の画像のさまざまなビューに評価値を重ね て表示し、ユーザーが初期評価値を調整できるようにします。 その後、コレクターは、画像をすぐに補 正するか、評価された収差パラメータのテンプレートを保存するために使用できます。 後者は、通常、 ビーズ画像からパラメータを評価した後に行われます。 このテンプレートは、同様の条件下で撮影され た画像に対してロードされ、そこでキャリブレーションされた色収差補正を実行するために使用されま す。